2022ATC深度解读（二）：ddcfDNA检测与Banff病理指标深度关联分析篇

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在供体来源游离DNA（ddcfDNA）检测与穿刺病理的配对研究中，已证明ddcfDNA可以诊断排斥反应。随着研究深入，临床开始进一步探索ddcfDNA检测值与Banff诊断指标的相关性。此次ATC会议共有6篇代表性研究聚焦于此方向，接下来我们详细解读。

First Research：Banff病理指标g、ptc、t、i、C4d等评分高低与ddcfDNA是否具有相关性？

已有的单中心小规模研究显示，ddcfDNA可以较特异性地诊断排斥反应。巴黎器官移植转化研究中心（Paris Translational Center for Organ Transplantation, Paris, France）的O. Aubert教授团队在更大规模样本上（1210个穿刺活检样本）验证了这一点，并对ddcfDNA检测值与Banff指标g、ptc、t、i、C4d和cg评分相关性进行了分析。该研究回顾性入组了992例肾移植患者，对其病理活检结果、HLA-DSA和肾功能指标同时评估。共有1210个病理活检结果和配对的ddcfDNA检测结果，分为训练集（N=637）和验证集（N=573）队列。在训练集队列中，包括100个AMR、14个TCMR和7个混合排斥反应（Banff 2019）。使用逻辑回归分析ddcfDNA单变量和包括ddcfDNA、DSA等在内的多重变量与排斥反应的关联，并使用独立关联的变量建立一个排斥风险诊断模型，进一步使用该模型在验证集队列中进行验证。结果显示，与其他类型移植肾损伤病理相比，AMR和/或TCMR中的ddcfDNA检测值显著较高（图1A）。

（图1A）

进一步分析显示，ddcfDNA检测值与Banff标准的急性病变指标呈线性相关，但与慢性病变指标无线性关联（图1B）。

（图1B）

在多重变量逻辑回归分析中，与排斥反应独立相关的变量（或因素）为HLA-DSA（p<0.0001）、ddcfDNA（p<0.0001）、eGFR（p=0.018）、近期排斥史（p<0.0001）和肾功能指标不稳定 (p=0.013)。风险模型显示，不含ddcfDNA变量的受试者工作特征曲线（ROC）的曲线下面积（AUC）为0.769，含ddcfDNA变量的AUC提高到0.827；在验证集队列中，不含ddcfDNA变量的AUC为0.786，含ddcfDNA变量的AUC提高至0.824。该研究认为：ddcfDNA在肾移植排斥诊断中可以作为独立相关风险变量。且该风险模型是首个可提高患者术后监测的综合系统（integrative system），有助于临床医生决策。

Second Research：ddcfDNA在C4d阳性ABMR与C4d阴性ABMR中的差异是什么？

ddcfDNA检测可以弥补肌酐的滞后性以及传统组织病理学诊断的多变性（不同病理医生阅片和不同穿刺点的差异）。德克萨斯大学加尔维斯顿医学分部（Internal Medicine，Nephrology，University of Texas Medical Branch，Galveston）的研究者通过使用ddcfDNA和MMDx检测对ABMR诊疗进行监测，并把ABMR分类为C4d阳性（C+）和C4d阴性（C-）进行比较，进一步评估ddcfDNA在两组间的差异。研究入组了50例ABMR患者，根据组织病理染色分为C4d阳性ABMR组（C+ABMR，16例）和C4d阴性ABMR组（C-ABMR，34例）。分别在穿刺前、穿刺后及治疗后，对其SCr、ddcfDNA和DSA指标进行检测。对C+ABMR组给予IV免疫球蛋白（IVIG）/血浆置换+/-硼替佐米治疗，对C-ABMR组给予IVIG治疗，治疗后两组的维持免疫抑制剂量都相应增加。结果显示，C+ABMR组50%患者和C-ABMR组52%患者呈DSA阳性。两组的ddcfDNA检测值在治疗后都明显下降，而肌酐无明显变化（图2）。另外，当以MMDx检测结果为金标准分析时，C-ABMR组有55%患者结果为ABMR阴性，而在C+ABMR组81%患者结果为ABMR阳性。

（图2）

该研究表明，在ABMR诊断和治疗后的监测流程中加入ddcfDNA检测，在传统病理活检流程中加入MMDx检测方案，有助于对ABMR患者早期识别、及时干预和个体化治疗。

Third~Fifth Research：目前临床对治疗临界性TCMR（boardline TCMR， BL-TCMR）还存在争议，在ddcfDNA结果与病理诊断不一致的病例上，ddcfDNA检测值是否有新的提示参考价值？

加拿大艾伯塔省移植应用基因组学中心（Alberta Transplant Applied Genomics Centre, Edmonton, AB, Canada）的P. F. Halloran教授团队分析了传统组织学活检诊断为BL-TCMR的患者，其ddcfDNA值与分子病理（MMDx）的特征。该研究共收集了426例病理活检样本，分为BL-TCMR组（46例），稳定组（56例）和急性肾损伤组（AKI，23例）；通过MMDx检测发现BL-TCMR组达到排斥的只有2例：1例ABMR，1例possible-TCMR，其余44例都不符合MMDx的排斥反应标准。对BL-TCMR组、AKI组和正常组的ddcfDNA和MMDx检测结果进一步研究发现，AKI组肾穿刺时间显著早于BL-TCMR组和正常组，而BL-TCMR组和正常组的穿刺时间无统计学差异（平均值、中位值和范围）。ddcfDNA值在AKI组、BL-TCMR组和正常组间呈梯度递减，与损伤相关基因转录表达评分一致。而排斥反应相关基因转录表达，在三组间无显著统计学差异（图3）。

（图3）

该研究表明，组织学的临界改变（BL-TCMR）主要与轻微分子损伤而不是排斥反应有关。其ddcfDNA值轻微升高，可能是实质损伤（parenchymal injury）的后期结果。因此，组织学临界改变可能是早期AKI的延续性损伤，不应视为排斥反应。

对于BL-TCMR Banff病理的肾小管炎（t0，t1，t2和t3）与肾间质炎（i0，i1，i2和i3）的不同组合，能否利用ddcfDNA检测值对同一组合（Banff病理诊断相同）的患者，进行区分、分层分类？

杜克大学（Duke University, Durham, NC）的M. J. Ellis教授团队对此进行了研究。该研究回顾性分析了病理活检诊断为BL-TCMR的患者中，其ddcfDNA检测水平与肾小管炎和肾间质炎的相关性。共入组了56例有病理活检结果（BL-TCMR，Banff 2019）、并在穿刺后30天内有ddcfDNA配对检测结果的患者。结果显示，56例患者ddcfDN中位值为0.34%（IQR：0.17-1.00）。其中3例评分t3/i1 (ddcfDNA%：0.04%，4.85%，9.06%），1例评分t1/i3（ddcfDNA%：3.03%），两种评分的入组患者数量较少。进一步把BL-TCMR的病理评分分为五组（t1/i1，t2/i1，t3/i1，t1/i2和t1/i3)，发现ddcfDNA值未有显著性差异。活检结果诊断为BL-TCMR的患者与活检诊断非BL-TCMR（孤立性肾小管炎：t1/i0，t2/i0或孤立间质性炎症：t0/i1）患者的ddcfDNA值也未有显著性差异（图4）。进一步分析发现，56例中有31例在指征性活检前63天（IQR：53.5-100）也进行了ddcfDNA检测，中位值为0.24%（IQR：0.20-0.37），两次检测结果相比，后一次的ddcfDNA检测中位值增加了55%（IQR:-9 - 235%）。

（图4）

该研究显示，BL-TCMR Banff病理表现相似，而ddcfDNA值有很大差异（ddcfDNA%：0.04%，4.85%，9.06% VS ddcfDNA%：3.03%）。而ddcfDNA值在BL-TCMR组、孤立性小管炎组和孤立性间质炎组间无显著差异。因此，表明BL-TCMR、孤立性小管炎和孤立性间质炎代表了一系列分子损伤（a spectrum of molecular injury），提示可以通过ddcfDNA值对它们进行风险分层。

对于TCMR（包括BL-TCMR）的风险分层，美国弗吉尼亚联邦大学（Virginia Commonwealth University, Richmond, VA）的D. Kumar教授团队进一步结合了MMDx和ddcfDNA检测，尝试进行分类。对比P. F. Halloran教授团队的研究，D. Kumar教授团队的研究入组了18例传统穿刺病理（H）和MMDx（M）都诊断（H+M+）为BL-TCMR的患者，并对照H+M-组进行分析。该TCMR队列共入组37例患者，其中H+M+ 18例，H+M- 19例，排除患有病毒/细菌性肾炎或混合排斥反应的患者，选择在TCMR治疗前检测ddcfDNA。结果显示，相比于H+M+组，H+M-组中位ddcfDNA值显著降低（p = 0.02）（0.32%；IQR: 0.15-0.43），在肾间质炎和小管炎（i+t）评分较高时表现更明显（4.8±1.5 vs 3.3±1.2，p=0.002）。对于H+M+组而言，“i+t”的评分和ddcfDNA值之间存在线性相关性，而对于H+M-组，“i+t”的评分和ddcfDNA值之间并无线性相关（图5）。

（图5）

另外，与H+M-组（40±23ml/min/1.73 m²）相比，H+M+组（27±19ml/min/1.73 m²）在穿刺后3个月及更长时间里，eGFR功能表现更差（p=0.06）（图6）。在治疗方面，89% H+M+患者都接受了排斥治疗（16/18；仅限14种rATG和2种类固醇），而只有37% H+M-患者接受了排斥治疗（7/19）。即使H+M-组没有全部接受排斥治疗，但在之后中位随访14.7个月时，两组eGFR都有显著改善：在H+M+组升高至34±24ml/min/1.73m²，在H+M-组升高至49±26ml/min/1.73m²，且3个月后H+M-组比H+M+组eGFR上升趋势更明显。

（图6）

该研究显示，对于分子病理阴性（M-）而传统病理活检阳性（H+）的TCMR患者，一般ddcfDNA检测值水平比较低。尽管这些患者没有进行针对性治疗，但后期肾功能有显著改善，这表明传统病理显示的low-grade TCMR可能是“对创伤的反应”，而不是排斥反应。无创ddcfDNA检测有利于对TCMR患者进行分级分类。

Sixth Research：ddcfDNA能否与基因表达谱检测组合运用以诊断MVI的发生？

ABMR主要病理表现为微血管炎症（Microvascular Inflammation, MVI），威斯康星大学麦迪逊分校的S. Parajuli教授团队希望通过同时使用ddcfDNA（Allosure，AS）和基因表达谱检测（Allomap kidney，AMK）来诊断MVI的发生。通过对All-MAP研究（NCT04057742）中DSA阳性肾移植患者进行前瞻性研究，分析了AS + AMK的综合评分（composite score）在诊断MVI>1时的特征。研究共入组了27个肾穿刺组织样本（26例患者），DSA I类MFI值为543±1497，II类MFI值为16374±14337。使用MVI =-9.1444+2.3122 * AS+0.5462 * AMK 公式可以区分MVI 0、MVI 1、MVI 2及以上样本。AS、AMK和AS + AMK综合评分的中位值分别为0.76、11.7和-0.3616 。AS + AMK综合评分在诊断MVI> 1时的AUC为0.87，具有很高准确性。当cut off值为-0.3981时，敏感性达到0.92，特异性达到0.73，PPV为0.73，NPV为0.92。当cut off值升高至0.82时，敏感性为0.58，NPV为0.75，特异性和PPV为100%；当cut off值降至-3.17时，敏感性和NPV分别为100%、特异性27%和PPV 52%（图7）。

（图7）

总结

ddcfDNA检测值与Banff中排斥类损伤指标有较好的线性关系，可以诊断微血管炎症的发生；
对C4d阴性的ABMR也有很好的诊断价值，并且对ABMR的治疗有疗效评估作用；
提示ddcfDNA可以作为BL-TCMR风险分类的生物标志物，有利于临床对BL-TCMR的精准治疗。

【参考资料】

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https://atcmeetingabstracts.com/abstract/development-and-validation-of-an-integrative-dd-cfdna-system-to-predict-allograft-rejection-a-population-based-study/.

2.Rizvi A,et al.Antibody-Mediated Kidney Allograft Rejection (ABMR) Monitoring and Intervention Based on ABMR Subtypes – A Step Towards Precision Diagnosis and Management[abstract]. Am J Transplant. 2022; 22 (suppl 3).

https://atcmeetingabstracts.com/abstract/antibody-mediated-kidney-allograft-rejection-abmr-monitoring-and-intervention-based-on-abmr-subtypes-a-step-towards-precision-diagnosis-and-management/

3.Halloran PF,et al.Histologic Borderline Reflects Molecular Injury Not Rejection: Results from the Trifecta Study[abstract]. Am J Transplant. 2022; 22 (suppl 3).

https://atcmeetingabstracts.com/abstract/histologic-borderline-reflects-molecular-injury-not-rejection-results-from-the-trifecta-study/.

4.Ellis MJ,et al.Wide Spectrum of Molecular Injury Highlights Heterogeneity of Banff Tubulitis and Interstitial Inflammation Lesions[abstract]. Am J Transplant. 2022; 22 (suppl 3).

https://atcmeetingabstracts.com/abstract/wide-spectrum-of-molecular-injury-highlights-heterogeneity-of-banff-tubulitis-and-interstitial-inflammation-lesions/.

5.Kumar D,et al.Correlation of Donor-Derived Cell-Free DNA with Histology and Molecular Diagnoses of T-cell Mediated Rejection in Kidney Transplant Biopsies[abstract]. Am J Transplant. 2022; 22 (suppl 3).

https://atcmeetingabstracts.com/abstract/correlation-of-donor-derived-cell-free-dna-with-histology-and-molecular-diagnoses-of-t-cell-mediated-rejection-in-kidney-transplant-biopsies/.

6.Parajuli S,et al.A Novel Approach to Non-Invasive Multimodality Testing with Allosure and Allomap Predicts Microvascular Inflammation with High Accuracy in Kidney Transplant Recipients [abstract]. Am J Transplant. 2022; 22 (suppl 3).

https://atcmeetingabstracts.com/abstract/a-novel-approach-to-non-invasive-multimodality-testing-with-allosure-and-allomap-predicts-microvascular-inflammation-with-high-accuracy-in-kidney-transplant-recipients/.

*图片及英文原文均来自2022ATC大会